2017諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎，果蠅助攻，帶你解讀生物鐘機制

理論上與生物鐘相關(guān)的問(wèn)題中zui重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物鐘可以解釋睡眠的相位（何時(shí)睡），但不能解釋睡眠本身。睡眠的機理目前理解很少。教科書(shū)中睡眠的內容相當大部分是腦電圖的描繪，是現象的描述不是機理的理解。

2017年諾貝爾生理學(xué)或醫學(xué)獎授予三名美國科學(xué)家邁克爾·楊（Michael W Young）、杰弗理·霍爾（Jeffrey C Hall）、邁克爾·羅斯巴希（Michael Rosbash），以表彰他們在研究生物鐘運行的分子機制方面的成就。

 評獎委員會(huì )說(shuō)，人們過(guò)去知道，包括人類(lèi)在內的許多生物都有內在的生物鐘，但其中原理卻長(cháng)期不清楚。這些科學(xué)家以果蠅為對象，分離出能夠控制晝夜節律的基因，并在分子層面揭示了相關(guān)蛋白質(zhì)的工作機制。

運氣，外在而縹緲；

勇氣，內生而實(shí)在。

運氣不會(huì )尋找勇氣；

勇氣可能碰到運氣。

在研究生物鐘基因的過(guò)程中，事先難以預料能否取得突破，事后分析發(fā)現勇氣足以成功，而運氣是錦上添花，雖然花開(kāi)的特別燦爛。

生物鐘是生物體內周而復始的節律，如人們熟知的：動(dòng)物的晝行夜伏、植物的春華秋實(shí)…。常見(jiàn)的近24小時(shí)晝夜節律（circadian rhythm）是典型的生物鐘之一。

生物鐘現象看似簡(jiǎn)單，其實(shí)不盡然。人們熟知的向日葵朝向太陽(yáng)，并非每天太陽(yáng)先出來(lái)、向日葵后轉向，而是向日葵先朝向、而后才有太陽(yáng)姍姍來(lái)遲。

生物鐘的本質(zhì)難以入手，研究不容易。人們用電生理方法研究而不得入門(mén)，1971年從果蠅的一個(gè)基因出發(fā)開(kāi)啟了生物鐘的基因研究，23年后才發(fā)現哺乳動(dòng)物*個(gè)生物鐘基因的突變，26年后明確哺乳類(lèi)的生物鐘基因與果蠅的類(lèi)似，30年后才發(fā)現同果蠅一樣的基因也控制人類(lèi)生物鐘。

驅動(dòng)生物鐘的內在機理隨著(zhù)一個(gè)一個(gè)基因的發(fā)現和研究，逐漸明朗，從果蠅到人存在同樣一批控制生物鐘的基因，它們編碼的蛋白質(zhì)合作共事，節律性地調節細胞內的基因轉錄，都采用了負反饋模式，并與光和溫度等外界因素協(xié)調，從而對應于地球自轉的近24小時(shí)節律。

生物鐘的存在和意義

生物節律與其他節律一樣，有震蕩的幅度、周期、相位。

節律是生物鐘的外在表現，生物鐘是內在的定時(shí)機理。生物鐘本身是自我維持的生理和行為節律發(fā)生器（pacemaker），可以受外界環(huán)境因素（zeitgebers）所導引、從而同步化。

生物有多種節律，不同的生物有著(zhù)不同的節律，同一生物也有多種節律。有些動(dòng)物每年一個(gè)周期的冬眠、有些植物每年一個(gè)周期的長(cháng)葉落葉，動(dòng)物還有更快的周期如呼吸和心跳…，而人們熟知的節律是晝夜節律。不僅大家熟悉的睡眠有晝夜節律，很多其他行為和生理指標也有晝夜節律。

現在知道，從簡(jiǎn)單的單細胞藍綠藻（cynobacteria）細菌到多細胞的人，很多生物有生物鐘的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有晝夜節律。晝夜節律周期接近24小時(shí)（常見(jiàn)22至25小時(shí)）。在環(huán)境線(xiàn)索缺乏時(shí)可以繼續維持，節律的相位由zui后一次環(huán)境線(xiàn)索（如光、或溫度等）所確定。在環(huán)境噪音中，節律照常運行。在一定范圍內，節律周期并不隨溫度的改變而劇烈改變，有溫度補償機制，這不同于一般生化反應：如溫度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。

晝夜節律的生物學(xué)意義目前仍不清楚。當然在進(jìn)化過(guò)程中，生物活動(dòng)與地球自轉相匹配，也許可以節省能量、或提率。但如果沒(méi)節律又會(huì )怎么樣呢？藍綠藻有晝夜節律，把正常的藍綠藻與生物鐘周期異常的細菌在一起長(cháng)期培養，發(fā)現zui后生物鐘正常的細菌占了絕大多數，由此可見(jiàn)生物鐘對生物體有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。擬南芥的研究也觀(guān)察到，周期縮短或延長(cháng)的擬南芥，其固碳量、生長(cháng)、存活都是與環(huán)境設定晝夜周期相吻合的擬南芥，即：短周期突變株在20小時(shí)晝夜環(huán)境下生活得更好；而長(cháng)周期突變株在28小時(shí)的模擬環(huán)境下更好（Dodd et al., 2005）。這些觀(guān)察，反映了只有當內外源周期保持一致時(shí)才zui有利于植物生長(cháng)。觀(guān)察到周期正常有利于植物，不等于能夠解釋為什么，所以我們仍然是知其然、不知其所以然。

偷懶是創(chuàng )新之母

遺傳篩選的實(shí)驗設計是：建立檢測表型的方法，用致變劑誘導特定生物的不同基因發(fā)生突變，檢測不同突變種的表型。具體到果蠅的生物鐘，就應該是建立檢測生物鐘的方法，用化學(xué)誘變劑誘導不同基因突變，然后一只一只檢測果蠅，以便發(fā)現改變了晝夜節律的突變種。

當時(shí)沒(méi)人知道果蠅有約兩萬(wàn)個(gè)基因，化學(xué)分子誘發(fā)隨機突變，只做兩萬(wàn)只果蠅不夠，其中部分突變在相同基因，所以應該加幾倍，才可能大部分基因都突變過(guò)一次。因行為有漂移，一個(gè)基因的突變種，不能僅檢測一只果蠅，應該檢測幾只到幾十只。果蠅是二倍體，每個(gè)基因有兩套，一套壞了可以被另一個(gè)等位基因所代償，所以不要做子一代（F1）的篩選，而是F2代，傳代后再篩選，而F2代只有四分之一是同一基因突變的純合子那么需要篩選的數量應一兩百萬(wàn)，才算做過(guò)全基因組的篩選。

檢測果蠅晝夜節律的標準方法，是將單只果蠅放到透明的管中，管子只容一只果蠅來(lái)回走動(dòng)。一束光射過(guò)小管的中央，凡是果蠅走過(guò)管中央，計算機就記錄果蠅運動(dòng)了一次。以此檢測果蠅活動(dòng)的變化，發(fā)現確實(shí)有晝夜規律。如檢測很多果蠅，工作量比較大。

Konopka和Benzer用了兩個(gè)偷工減料方法來(lái)加快速度。其一是果蠅遺傳學(xué)*的attached X，可以快速檢測X染色體的突變。其二是他們決定不篩選晝夜節律，而篩另一節律：果蠅羽化。果蠅受精卵成為胚胎，發(fā)育成為幼蟲(chóng)，三次蛻皮后成為蛹，蛹經(jīng)過(guò)羽化成為成蟲(chóng)。

晝夜活動(dòng)節律是果蠅成蟲(chóng)每天經(jīng)歷一次、幾十天周而復始的循環(huán)。而果蠅一生僅羽化一次。羽化一般在黎明前，zui遲也在上午。三十年代到五十年代的研究明確提出羽化為獨立于溫度的生物鐘所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物鐘與成蟲(chóng)每天的活動(dòng)生物鐘，是否有關(guān)，當時(shí)并不清楚。

Konopka覺(jué)得羽化作為篩選方法很容易操作。用單只果蠅做經(jīng)典的晝夜活動(dòng)規律檢測比較慢。如果用羽化作為篩選方法，就很便當：化學(xué)誘變處理得到各種突變的果蠅猴，Konopka每天上午不來(lái)上班，午后到實(shí)驗室把所有羽化的果蠅倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影響節律的突變種，因為它們的羽化時(shí)間不同于正常（所謂“野生型”）果蠅。這樣的方法大大簡(jiǎn)化了檢測、加速了篩選。

運動(dòng)監視器

羽化監視器

對于一個(gè)研究生來(lái)說(shuō)，用如此簡(jiǎn)單的方法，不難篩選幾萬(wàn)只、幾十萬(wàn)只、幾百萬(wàn)只果蠅。但Konopka只篩選了不到兩百種品系的果蠅就得到*個(gè)突變品系，繼續篩選不到兩千種品系的果蠅再得到兩個(gè)突變品系。

他們用羽化篩到突變品系后，更重要的是用標準檢測運動(dòng)的晝夜節律之方法看個(gè)體的晝夜活動(dòng)是否變化，結果發(fā)現確實(shí)突變果蠅的運動(dòng)晝夜節律異常。有趣的是，他們發(fā)現的三種品系的突變果蠅在表型上并不相同：一種沒(méi)有節律，一種節律周期長(cháng)短加快到19小時(shí)，一種節律變慢到28小時(shí)。他們進(jìn)一步將突變種與已有的其他突變交配，確立三種突變在染色體圖譜的大概位置，結果發(fā)現很近，他們進(jìn)一步把三種突變相互交配，進(jìn)行本哲發(fā)明的順?lè )礄z測，試圖確立它們是否同一基因，他們根據得到的結果推測三種突變可能是同一個(gè)基因的不同突變。他們把這個(gè)基因命名為period（簡(jiǎn)寫(xiě)per），無(wú)節律的為per0（per zero）、節律短的為pers（per short）、節律長(cháng)的為perl（per long）。這里需要說(shuō)明，他們進(jìn)行的順?lè )礄z測并不嚴格，只做了反位（trans）的檢測沒(méi)做順位（cis）的檢測，所以只從1971年的文章不能*斷定三個(gè)突變是否同一基因，雖然當時(shí)的結果支持這一可能。

他們篩選的果蠅數量不多，卻得到了一個(gè)基因的三種不同方向的突變，因此顯得特別有運氣。

各種篩選和檢測生物鐘的方法，都有可能在一些非生物鐘關(guān)鍵的基因導致的突變而有所影響。同一個(gè)基因可以出現三個(gè)方向的突變，不僅是運氣，而且對于這個(gè)基因的功能也提供了很好的支持：很難設想不參與驅動(dòng)生物鐘的基因可以導致三個(gè)不同方向的突變表型。如果三個(gè)突變確為一個(gè)基因的三種突變，那么per基因很可能是生物鐘的關(guān)鍵基因之一。

果蠅與哺乳類(lèi)是否有類(lèi)似的分子機理？

如果果蠅的per基因只是在果蠅和昆蟲(chóng)起作用，那么意義就有限。如果找到高等動(dòng)物的Per并因此開(kāi)啟研究高等動(dòng)物生物鐘的分子機理，那么意義就較大。

果蠅的per基因在1984年被克隆后，長(cháng)期有人（如麻省大學(xué)伍斯特校區的Steven Reppert）試圖在高等動(dòng)物中找到Per基因，但無(wú)果。一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)基因在低等動(dòng)物中發(fā)現后，在高等動(dòng)物中比較容易找到，有多種方法可以通過(guò)DNA序列相似性找到。找不到有幾種可能：Per在高等動(dòng)物不存在，例如果蠅的生物鐘可能高等動(dòng)物的生物鐘不同，也可以是果蠅和高等動(dòng)物生物鐘大體類(lèi)似但其中有分子不同（如果蠅用per但高等動(dòng)物不用）；另一可能是研究者技術(shù)上的問(wèn)題，在高等動(dòng)物存在Per基因，但未被找到。從1984年到1997年的努力都找不到哺乳動(dòng)物的per基因的情況下，很多人灰心地認為恐怕哺乳類(lèi)無(wú)Per。

1997年，兩個(gè)實(shí)驗室歪打正著(zhù)，找到老鼠和人的Per（Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美國華人科學(xué)家在研究其他問(wèn)題的時(shí)候，發(fā)現一個(gè)基因與per有序列相似性（Sun et al., 1997）。比較它們后知道，以前沒(méi)找到的原因是哺乳類(lèi)的Per與果蠅的per基因在整個(gè)基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整體去找很難找到，而用局部的困難在當時(shí)并不知道哪段是保守的。

哺乳類(lèi)的Per基因有三個(gè)：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表達在SCN（Shearman et al., 1997），其表達隨晝夜節律變化而變化，這一節律受Clock基因的調節（Jin et al., 1999）。

1998年，霍爾—羅斯巴希組通過(guò)遺傳篩選，也在果蠅找到Jrk基因，發(fā)現就是果蠅的clock基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay實(shí)驗室發(fā)現clock蛋白可以激活帶有per基因啟動(dòng)子片段E-box驅動(dòng)的熒光素（luciferase）報告基因的表達，這一激活能被per自身所抑制，從而較好地實(shí)現負反饋環(huán)路的閉合（Darlington et al., 1998）。

首先在果蠅發(fā)現的per基因終于在哺乳類(lèi)找到了，而首先在老鼠發(fā)現的基因Clock也在果蠅中發(fā)現了，從昆蟲(chóng)到哺乳類(lèi)，生物鐘的基因看來(lái)高度保守。這雖然是基因水平，但提示機理也保守。

從研究來(lái)說(shuō)，鉆研果蠅生物鐘的科學(xué)家們就不用再擔心是自己怪癖，而確實(shí)可能是探討和揭示動(dòng)物相通的普遍機理。