美國nightsea SFA DFP熒光濾光片的選擇指南

   由于GFP（綠色熒光蛋白）和其他綠色發(fā)光體（例如FITC）是使用廣泛的熒光染料，因此我們的寶藍色激發(fā)/發(fā)射裝置是體視鏡熒光適配器常用的選擇。在黃色Longpass和綠色bandpass屏障濾波器選項之間進(jìn)行選擇時(shí)，經(jīng)常會(huì )要求我們提供建議。本文將介紹每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

光譜特性

• Longpass –傳輸所有大于500nm的波長(cháng)
• bandpass –僅在500 – 560nm之間傳輸

實(shí)際上，這意味著(zhù)bandpass僅傳輸綠色波長(cháng)，而Longpass則傳輸綠色，黃色，橙色和紅色。

濾光片作用

     熒光應用中任何濾光片的目的都是為了增加您想要看到的東西（“信號”）的觀(guān)看對比度。主要工作是阻擋來(lái)自激發(fā)源的反射光并透射熒光發(fā)射。其他潛在的干擾源（“噪聲”）是觀(guān)看區域中其他物質(zhì)的熒光，這些物質(zhì)可以掩蓋目的信號。這可能是來(lái)自諸如生長(cháng)培養基（與秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)一起使用時(shí)）或對象本身的一部分（例如植物中的葉綠素或發(fā)育中的斑馬魚(yú)卵黃）之類(lèi)的背景熒光。

Longpass濾光片和bandpass濾光片都可以很好地阻擋激發(fā)光。

盡管您可能會(huì )認為選擇與預期釋放量緊密匹配的濾光片會(huì )更好，但這并非總是如此。

    如果您要消除的噪聲與信號沒(méi)有重疊，則bandpass是一個(gè)不錯的選擇。例如，在擬南芥或其他植物中，葉綠素發(fā)出的紅色熒光就是這種情況，如下圖所示*。葉綠素發(fā)出遠紅色的光，其峰值在約685 nm處。在使用Longpass濾光片制作的左側圖像中，紅色熒光難以區分綠色GFP熒光。綠色的bandpass濾光片消除了這種情況，使您很容易看到葉子中的GFP熒光。

      如果噪聲與信號頻譜重疊，則bandpass濾波器可能會(huì )引起混淆。使用Longpass濾波器，您可以通過(guò)兩種潛在的方式將信號與噪聲區分開(kāi)：強度和 顏色。使用bandpass濾鏡，您可以刪除顏色（光譜），而僅保留強度。下面的熒光轉基因斑馬魚(yú)圖像說(shuō)明了這一點(diǎn)。這條魚(yú)**在心臟中表達GFP，在血細胞中表達mCherry。下圖是兩幅圖像的合成-一幅是使用Longpass濾波器拍攝的，另一幅是使用綠色bandpass濾波器拍攝的。

通過(guò)Longpass（頂部）和bandpass濾光片拍攝的轉基因熒光斑馬魚(yú)

     在頂部圖像中，您可以看到綠色熒光的心臟，紅色熒光的血細胞和蛋黃的天然黃色熒光。這些很容易區分。在下部圖像中，所有內容均以不同的綠色強度顯示。心臟明亮，但蛋黃沒(méi)有那么暗。說(shuō)所有綠色都與GFP表達有關(guān)是不正確的。在這種情況下，*好使用Longpass濾鏡觀(guān)看物體。

      在某些情況下，選擇不太明顯。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的生長(cháng)培養基具有一些背景綠色熒光。與黃色長(cháng)通相比，綠色bandpass濾鏡確實(shí)增加了一些清晰度和對比度。在許多測試中，我們讓數名觀(guān)察員觀(guān)察了相同的樣本。有些人喜歡長(cháng)通，因為他們認為這實(shí)際上有助于查看背景的某些背景，而另一些人則喜歡同一樣品的帶通。在這種情況下，很可能還有其他選擇，選擇并不*明顯，可能取決于個(gè)人喜好。

如果您正在自然探索熒光？長(cháng)傳肯定是要走的路。您無(wú)法使用帶通濾鏡捕獲此草花的圖像。

* 擬南芥  由波士頓大學(xué)的John Celenza博士提供。

**斑馬魚(yú)由Martha Marvin博士（威廉姆斯學(xué)院）提供，這是由Lara Hutson博士（布法羅大學(xué)）培育的轉基因品系。